Сборная солянка по MicroArray


Итак, первое, с чего лучше всего начать, где наглядно объясняется что это такое -- микроаррей, и зачем он вообще нужен: http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/

Что у нас есть:

Множество функциональных генов, сейчас у человека уже около 30000.
Эти гены есть во всех тканях человека.
Но, в разных тканях включены разные гены. Например в мышечных клетках, включены гены, которые строят Миозин и Актин. В гепатоцитах эти гены, скорей всего, будут выключены.

Получается, у нас есть куча генов и наша задача заключается в следующем: определить, какие гены включены в определенной ткани (или даже в определенной ткани, если она поражена -- имеет определенную патологию). Продолжение: сравнить полученный "генетический профиль" (паспорт -- если хотите) клетки одной ткани с другой, или сравнить "генетический профиль" клетки одного и того же типа в норме и патологии. Для того, чтобы определить отдельный ген -- всего один -- можно заморочиться и поставить целый эксперимент, чтобы определить, работает он в этой такни или нет. Так было в самом начале, но теперь все это уже проделано много раз и есть инструменты, чтобы проделывать снова и снова -- как раз для выявления различий в экспресси генов в патологических тканях.

Для этого и нужны чипы. Чип, это массив данных -- такая матрица, которая содержит данные по всем геннам (часто по их матричным РНК) клеток определенной такани. Т.е. такой чип выдаст нам на выходе сигналы, которые покажут, какие гены экспрессируются (включаются), а какие нет у взятых клеток.

Сами чипы делают различными способами. Раньше это был ручной труд, на том же ПЦР, сейчас это делают роботы -- то же на ПЦР (часто), но не только.

Практика сейчас такая: вы, конечно, если у вас есть серьезная лаборатория, можете сами подготовить себе кастомные чипы. Но, это время, ресурсы, оборудования и т.д. По этому нужные чипы покупаются у компаний, которые этим активно занимаются и делают чипы на все случаи жизни, а если не делают, то вы можете заказать то, что вам нужно. Рынок этот сейчас весьма плотный и насыщенный -- конкуренция есть, значит и движения тоже есть. Постоянно появляются новые приемы и технологии.

Например есть GeneChip -- это microarray чип, который производит фирма Affymetrix -- одна из лидирующих компаний по производству чипов. GeneChip -- это что-то вроде копьютерных чипов, которые Affymetrix активно печатает -- технология поставленна на поток: чипы становятся меньше, удобней и содержат при этом все больше информации.

Microarray чипы называют по разному, грубо говоря, речь об одних и тех же чипах: DNA microarray, gene chip, expression chip, gene array.

Итак, чип -- это матрица содержащая множестов ячеек -- так называемых "спотов". Каждый "спот" представляет один и только один уникальный ген. Причем в кажом споте содержиться несколько копий этого гена, так, на всякий случай, малоли что (с другой стороны, это можно использовать, для различий между активностью этого гена в разных типах клеток).

Итак, один из важных вопросов, который нам позволяют решить генны чипы: Чем отличается раковая клетка от здоровой?

Если мы тупо посмотрим в микроскоп -- то вовсе не обязательно, что мы увидим различия в их морфологии или иные визуальные отличия. Как же быть?

Что же отличается раковую клетку от нормальной? Собственно грубо говоря: рак, это когда некоторые гены работают не правильно (или вообще не работают, а должны).

Многие гены контроллируют процессы роста, деления и уничтожения клетки. Если эти гены перестают работать, клеточное деление может выйти из под контроля и начать бесконтрольно плодить все новые и новые клетки. В нормальном состоянии существует равновесии между делением и смертью клеток -- т.е. множество генов работают так, чтобы удерживать подобное равновесие. Но вот если многие гены отключить, и возможно при этом включить другие, такое равновесие нарушится.

Сложность тут в том, что разные типы рака, нарушают действие разных генов.

Именно по этому, чтобы понять нам, что за рак у данного человека, нам нужно всего лишь понять, какие гены у него "включены".

Как это делается:

1. Берется проба нужной ткани.
2. Выделяется РНК.
3. Выделяется матричная РНК.
4. Создается помеченная ДНК-копия.
5. Берут получившуюся ДНК и анализируют ее на генном чипе.
6. Анализируют данные.

Проба нужной ткани: здесь все просто, можно прямо скальпелем отрезать небольшой участок опухоли -- если это меланома. Также нужно отрезать небольшой участок эпителия не имеющего патологии. Получим на выходе две пробирки.

Далее нам нужен специальный растворитель, чтобы отделить все ненужное от тканей и оставить только РНК. Добавляем растворитель в пробирки.

После берем Vortex и создаем однородный раствор в пробирках.

Теперь в бой вступает микроцентрифуга -- устройство, которое вращается на очень большой скорости и разделяет вещество в пробирки по размеру и плотности.

После центрифугирования РНК окажется в верхней части нашей пробирки, т.к. остальные молекулы будут более тяжелыми и длинными.

Затем отбираем эту верхнюю фазу и добавляем ее в новые две пробирки: теперь у нас есть выделенные РНК с нормального эпителия и с патологического.

Выделенные РНК не одинаковые, а состоят из: трансферной РНК, рибосомальной РНК и матричной РНК.

Матричная РНК легко отличается от всех остальных -- у нее на конце хвост из идущих подряд аденинов (poly-A). Именно эта РНК нас и интерессует, потому как она несет команду какие белки транскрибировать.

Для этого мы опустим наш раствор в специальный колонки, на стенках которых есть специальные поли-тиминовые участки (метки), которые будут связываться только с поли-адениновыми концами. Тем самым на колонках останутся только нужные матричные РНК, с остальными же мы расстанемся навсегда.

Теперь нам нужно отсоединить связанные РНК от поли-тиминовых концов. Для этого используется специальный буфер -- им мы и промоем наши колонки.

Затем мы пометим образцы разным цветом, чтобы не запутаться. Метят РНК флуорисцентными метками.

Метку будем наносить при построении нужной нам ДНК. Для этого добавим в раствор поли-тиминовых праймеров, который свяжутся с поли-адениновыми хвостами на наших РНК и будут служить "застравкой" для старта построения колмплементарной ветки.

В раствор добавим специальные помеченные нужным цветом нуклеотиды, и когда обратная транскриптаза пойдет достравивать ветку от поли-тиминового праймера, она будет использовать в качестве материала помеченные нуклеотиды.

Матричная РНК деградирует, и у нас остоется одна из веток ДНК, которая нам и будет нужна.

Далее идет ключевой момент микрочипов: ДНК-гибридизация.

На чипе имеется большое количество лунок (матрица), которые уже содержут по несколько копий одноцепочечной ДНК одного из генов. Если мы добавим на чип полученные нами ранее одноцепочечные ДНК они будут искать комплементарные им нити и гибридизоваться с ними (соединяться) -- таким образом образуя зеленое или красное свечение, или сразу оба.

Т.е. у нас получается 4 типа сигналов (условно): красный, зеленый, красный + зеленый, отсутствие сигнала.

Прежде чем сканировать полученные данные, мы должны смыть несвязавшиеся цепочки ДНК -- для этого просто используется раствор.

Все, теперь можно анализировать, что же получилось.

Ну все просто: те споты, которые и зеленые и красные не интересны -- значит активность генов не изменилась: одинаковая в норме и в патологии.

Интересны те гены, которые дают красный сигнал. Это вовсе не значит, что все они изменились сами -- большинство из них изменились опосредованно, путем влияния генов, экспрессия которых была изменена изначально, получаются целые каскады, петли и сигнальные пути -- когда один ген начинает влиять на следующий ген, а тот на следующий и т.д. -- вот они все будут давать красный сигнал. Но нам надо найти первоначальных виновников -- устранив их, остальные не будут менять своей привычной работы и останутся в зеленой зоне.

Изображение взято с сайта wikipedia.org

Tags: 

Comments

редкий случай благородства -- оставляю спам-комментарий, по случаю хорошего настроения. :)

Add new comment

Filtered HTML

  • Web page addresses and e-mail addresses turn into links automatically.
  • Allowed HTML tags: <a> <em> <strong> <cite> <blockquote> <code> <ul> <ol> <li> <dl> <dt> <dd>
  • Lines and paragraphs break automatically.

Plain text

  • Web page addresses and e-mail addresses turn into links automatically.
  • Lines and paragraphs break automatically.
CAPTCHA
This question is for testing whether or not you are a human visitor and to prevent automated spam submissions.
10 + 2 =
Solve this simple math problem and enter the result. E.g. for 1+3, enter 4.